Iso-Seq analysis
解析概要
PacBioシーケンサーを使用したRNA-Seq（Iso-Seq）では、真核生物において網羅的なmRNAの全長配列を決定することができます。
解析原理
mRNAを断片化せずにライブラリ化し、SMRT Cellの小孔で1分子のcDNAを繰り返しシーケンスします。 リードのコンセンサス配列が、トランスクリプトの 全長配列となります。
解析の流れ
推奨データ取得量
| 機種 | Sequel または SequelⅡ |
| データ量 | 20Gb ～ 40Gb subreads / sample |
※ Sequel II による 20Gb, 30Gb, 40Gb の乗り合い解析プランがご利用いただけます。
解析メニュー
【トランスクリプト配列作成】
シーケンスデータからコンセンサス配列を作成し、poly Aなどの配列末端構造の確認、塩基補正工程を経て、高精度なトランスクリプト配列を作成します。
シーケンスデータからコンセンサス配列を作成し、poly Aなどの配列末端構造の確認、塩基補正工程を経て、高精度なトランスクリプト配列を作成します。
【アノテーション情報付与】
トランスクリプト配列に対して、既知遺伝子データベースを参照したBLAST検索を行い、相同遺伝子情報を付与します。
トランスクリプト配列に対して、既知遺伝子データベースを参照したBLAST検索を行い、相同遺伝子情報を付与します。
サンプル必要量
| 提供サンプル種別 | 総量 | 濃度 | 液量 |
| total RNA | 1.5 ug 以上 | 50 ng/uL 以上 | 30 uL 以上 |
よくある質問と回答
Q：遺伝子発現量を算出することはできますか
PacBioのシーケンス原理上、ライブラリのサイズにより取得データ量にバイアスが生じるため、PacBioのシーケンスデータを用いて遺伝子発現量を算出することはできません。
別途、IlluminaのRNA-Seqデータを取得し、PacBioで得られたトランスクリプト配列にマッピングすることで、各トランスクリプトの発現量を算出することができます。
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PacBioのシーケンス原理上、ライブラリのサイズにより取得データ量にバイアスが生じるため、PacBioのシーケンスデータを用いて遺伝子発現量を算出することはできません。
別途、IlluminaのRNA-Seqデータを取得し、PacBioで得られたトランスクリプト配列にマッピングすることで、各トランスクリプトの発現量を算出することができます。