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メタトランスクリプトーム解析

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解析概要

様々な微生物が混在する環境試料から抽出されたTotal RNAよりRNA-Seq用ライブラリを作製し、網羅的なシーケンスを行うことで、試料中に存在する微生物の種類や機能遺伝子の発現状況を明らかにします。
Ribo-Zero試薬を利用することで不要なribosomal RNAの除去し、効率的な解析が行えます。

解析の流れ

解析仕様

 使用機器 Illumina NovaSeq 6000
 読み取り方法 Paired-End法（150bp x 2）
 データ取得量 6Gb/検体（2000万リードペア/検体）
又は、12Gb/検体（4000万リードペア/検体）※1
 作業内容 サンプル品質検査、ライブラリ調製、シーケンス、データ解析
  • ※1 データ取得量は、6Gb, 12Gb単位の2パターンを標準プランとしていますが、1Gb単位で任意変更可能です。ご希望がございましたら事前にお問い合わせください。

解析内容

  • Data Quality Control

Rawデータに対しQuality Controlを行い、有効データに変換します。

  • Transcriptome Reconstruction

NCBIの配列情報を利用してrRNAやtRNAなどの非目的RNAを除去し、残ったリードをTrinityソフトウェアを使用してアセンブルします。その後、CD-HIT-ESTソフトウェアを使用して冗長性（重複した配列や類似した配列）を削除することで、一意の遺伝子セット（unigene）を取得します。

  • Species Annotation

unigeneをバクテリア、真菌、古細菌、ウイルスの配列に比較し、フィルタリングによって生物学的に意義のあるアライメント結果を取得します。遺伝子の豊度情報と組み合わせ、サンプルの各分類レベルごとの情報を視覚化します。

  • Function Annotation (GO / KEGG / eggNOG / CAZy)

unigeneがどのような機能を持つかを推定します。既存のデータベース（GO、KEGG、eggNOG、CAZy）内の配列との類似性を評価します。

  • Gene Expression Analysis / Gene Expression Difference Analysis

Trinityによって構築したトランスクリプトームをリファレンスにリードのマッピングを行い、遺伝子の発現量を算出します。ノーマライズ後、検体間・群間比較を行い、発現変動遺伝子を抽出します。

  • Enrichment Analysis (GO / KEGG)

発現変動遺伝子群に対し、既存のデータベース（GO、KEGG）内の遺伝子との関連性を評価します。

サンプル必要量

提供サンプル種別 総量 濃度 液量
total RNA 1.5 ug 以上 50 ng/uL 以上 30 uL 以上
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