CRISPRスクリーニング解析

サービスアップデート
これまで有料オプション解析としておりました「比較テーブル作成」を標準解析にてご提供します。

解析概要

CRISPR gRNAライブラリを使用したゲノムワイドスクリーニングにご利用いただける次世代シーケンス解析サービスです。gRNA領域のPCR産物をご提供いただき、ディープシーケンス、gRNAのリードカウントを行います。

 

サービス内容

 データ量について

データ量は、リードペア数 x リード長 x 2(ペア)となります。150bpで1,000万リードペアを読む場合、10,000,000 x 150bp x 2 = 3,000,000,000 b = 3Gb となります。

また、リードペア数 / gRNAの種類数 = カバレッジ となります。CRISPRスクリーニング解析には、一般的に x100 ~ 500 カバレッジ程度の深度が推奨されています。

例えば、12万種類のgRNAライブラリについて平均100カバレッジとなるデータを取得するには、12万 x 100 = 1,200万 リードペアとなり、データ量は 12,000,000 x 150bp x 2 = 3.6Gbのように計算します。

ご使用のgRNAライブラリの種類数、および、ご希望のカバレッジに応じて取得データ量(リードペア数)を ご設定ください。

 

納品データ

品名 内容 形式 詳細
書面
・作業報告書
作業内容の概要
・Sequencing Report
シーケンスデータに関する解説書
記録メディア
・DVD-R
・USBメモリ
・HDD 等
・シーケンスデータ
fastq / txt / xlsx シーケンスで得られた配列データと対応するクオリティスコア(fastq)、および、シーケンスのサマリー情報
・PreProcessingデータ
fastq / txt / xlsx データQCやトリミングなどの前処理を行ったデータ、および、前処理のサマリー情報
・gRNAカウントデータ
txt / xlsx MAGeCKプログラムを使用して算出した、各検体のgRNAのカウントデータ データ見本1
・検体比較結果
txt / xlsx MAGeCKプログラムを使用して算出した、検体間・群間の比較結果 データ見本2 / データ見本3
・リファレンス情報
txt 解析に使用した、gRNAライブラリの配列情報
・パラメータシート
txt 解析に使用したプログラムと条件値の一覧
・Analysis Report
pdf データ解析に関する解説書
・付加情報
pdf fastq閲覧用のフリーソフトのご案内や、ライブラリ構造の図解

データ見本1 : gRNAのリードカウントテーブル

gRNA ID gRNA Sequence SampleA Count
ID_0001 AAATACAAACAACTCTGAG 213
ID_0002 GAAGTGTCCCAGGGCGAGG 294
ID_0003 ACTCTATCACATCACACTG 35

データ見本2 : gRNAのカウント比較テーブル

gRNA ID Control Test LOG2FC p_value FDR High in Treat
SampleA SampleB SampleC SampleD
ID_0001 213 274 883 175 1.12 0.9996 0.00699 FALSE
ID_0002 294 412 1554 1891 2.29 0.0000 0.00000 TRUE
ID_0003 421 368 566 759 0.75 0.9995 0.00726 FALSE

データ見本3 : 遺伝子のnegative/positive selection情報

Gene negative selection positive selection
p_value FDR Rank p_value FDR Rank
RPS5 0.000 0.000236 1 1.000 1.000 19147
YARS 0.000 0.000236 2 1.000 1.000 19146
GTF2B 0.000 0.000236 3 1.000 1.000 19145
NRF1 0.000 0.000236 4 1.000 1.000 19144
NLE1 0.000 0.000236 5 1.000 1.000 19143

ご用意いただくもの

サンプル
gRNA領域のPCR産物
■ PCR産物の構造

    • 1. 弊社指定のリンカー配列(※配列はお問い合わせください)を付加したプライマーでPCRを実施し、そのPCR産物(リンカー配列付き)をご提供ください。
    • 2. リンカー配列を除くインサートサイズは200~400bp程度、その内5’側の100bp以内にgRNA領域を含むようプライマーを設計してください。(上図参照)
    • 3. ご提供いただくPCR産物の量は5ng(0.2ng/μL)以上を目安にご用意ください。
    • 4. PCR産物は精製を行い、プライマーや非特異的産物を除去してください。

 

 1st PCRに使用する鋳型量について
CRISPRスクリーニング実験でNGS解析を実施する際に行う1st PCRでは、スクリーニング処理後の細胞内に含まれるsgRNAのバリエーションを充分にカバーするため、ゲノム抽出の際の細胞数や1st PCRに投入する鋳型の量を検討する必要があります。
ヒトやマウスの1細胞内に含まれるゲノムDNA重量は約6.6~7pgと見積もられますので、例えば約5万種類のsgRNAライブラリを対象として、全sgRNAの種類数に対し300~500カバレッジを想定する場合、鋳型の必要量は約100ug程度と見積もられます。
ご利用のsgRNAやスクリーニング条件に応じて、必要な鋳型量を算出し、PCRボリュームや反応本数を適宜調整してください。
 コントロールサンプルについて
検体のgRNAリードカウントはコントロールサンプルが無くても可能ですが、スクリーニングによるゲノム編集への影響を比較検証するためには、スクリーニング前(gRNAエンリッチ前)のコントロールサンプルについても同時にデータ取得することをお勧めいたします。
コントロールサンプルは、トランスフェクション後の培養細胞のday0(未処理)サンプルや、トランスフェクション前のgRNAライブラリなどが使用されます。
参照データ
gRNAリスト

gRNAリードカウントには、gRNAライブラリの配列情報が必須となります。
購入先のURLやカタログ番号等、配列情報の入手経路をご教示いただくか、下表のようなID、配列、対象遺伝子の対応表をご提供ください。

■ gRNAリストの例
gRNA ID gRNA配列 Gene
ID_0001 AAATACAAACAACTCTGAG GeneA
ID_0002 GAAGTGTCCCAGGGCGAGG GeneB
ID_0003 ACTCTATCACATCACACTG GeneC
記入書類
注文書

下記より注文書をダウンロードいただき、必要事項をご記入ください。
Illumina注文書(CRISPRスクリーニング解析用)

サービス一覧へ戻る
Page Top