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CRISPRスクリーニング解析

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★データ解析アップデート★
これまで有料オプション（追加解析）としておりました「検体間比較テーブル作成」を標準解析メニューにてご提供いたします。

 

CRISPR gRNAライブラリを使用したゲノムワイドスクリーニングにご利用いただける次世代シーケンス解析サービスです。
gRNA領域のPCR産物をご提供いただき、ディープシーケンス、gRNAのリードカウントを行います。

 

サービス内容

gRNA領域のPCR産物をご提供いただき、ライブラリ調製、Illuminaシーケンスデータ取得、gRNAのリードカウントを実施いたします。
比較対象のサンプルがある場合は、比較テーブル作成も承ります。

gRNA領域のPCR
（お客様にて実施）

ライブラリ調製

Illuminaシーケンスデータ取得

gRNAのリードカウント

比較テーブル作成

 

解析プラン

<標準プラン内容>

・ライブラリ調製
・Illumina 150PE シーケンスデータ取得
約330万リードペア（1Gb）単位で、ご希望のリード数にて承ります。
・gRNAのリードカウント

<価格>

お問い合わせください。
※ ご希望のリード数をお知らせいただけましたらお見積りいたします。

 

納品データ

シーケンスで得られたリード配列からgRNA領域を切り出し、各gRNAのリード数を集計します。Control、Treatの比較実験の場合は、gRNAリード数集計後、各サンプルで算出されたgRNAカウント情報にもとづき、ControlサンプルとTreatサンプルのカウント比較テーブルを作成します。また、gRNAのエンリッチ情報をもとに、gRNAがターゲットとする遺伝子ごとのnegative/positive selection情報も算出します。

【gRNAのリードカウントテーブル】

gRNA ID gRNA Sequence SampleA
Count
ID_0001 AAATACAAACAACTCTGAG 213
ID_0002 GAAGTGTCCCAGGGCGAGG 294
ID_0003 ACTCTATCACATCACACTG 35

【gRNAのカウント比較テーブル】

gRNA ID SampleA
(Control)		 SampleB
(Control)		 SampleC
(Treat)		 SampleD
(Treat)		 LOG2FC p_value FDR High in
Treat
ID_0001 213 274 883 175 1.12 0.9996 0.00699 FALSE
ID_0002 294 412 1554 1891 2.29 0.0000 0.00000 TRUE
ID_0003 421 368 566 759 0.75 0.9995 0.00726 FALSE

【遺伝子のnegative/positive selection情報】

Gene negative selection positive selection
p_value FDR Rank p_value FDR Rank
RPS5 0.000 0.000236 1 1.000 1.000 19147
YARS 0.000 0.000236 2 1.000 1.000 19146
GTF2B 0.000 0.000236 3 1.000 1.000 19145
NRF1 0.000 0.000236 4 1.000 1.000 19144
NLE1 0.000 0.000236 5 1.000 1.000 19143

ご用意いただくもの

●サンプル： gRNA領域のPCR産物
下記①～④の条件を必ずご確認ください。

  • ① ご提供いただくPCR産物の量は5ng（0.2ng/μL）以上を目安にご用意ください。
  • ② 弊社指定のリンカー配列（※配列はお問い合わせください）を付加したプライマーでPCRを行っていただき、リンカー配列の付いたPCR産物をご提供ください。
  • ③ PCR産物（リンカー配列を除くインサートサイズ）は200～400bp程度、その内5’側の100bp以内にgRNA領域を含むようプライマーを設計してください。（上図参照）
  • ④ PCR産物の精製を行ってください。

●参照データ： gRNAリスト
gRNAのID、配列、対象Geneの対応表をご提供ください。
データ解析（gRNAのリードカウント）で使用いたします。

【gRNAリスト例】

gRNA ID gRNA配列 Gene
ID_0001 AAATACAAACAACTCTGAG GeneA
ID_0002 GAAGTGTCCCAGGGCGAGG GeneB
ID_0003 ACTCTATCACATCACACTG GeneC

よくある質問と回答

Q：コントロールサンプルは必要ですか
スクリーニング前後でgRNAのカウント数を比較するために、スクリーニング前（gRNAエンリッチ前）のコントロールサンプルが必要になります。コントロールサンプルがない場合でも、各検体のgRNAリードカウントを行うことは可能です。

Q：コントロールにはどのようなサンプルが使用されますか
コントロールサンプルには、トランスフェクション前のgRNAライブラリ、またはトランスフェクション後の培養細胞のday0（未処理）サンプルなどが使用されます。

Q：レプリケートは必要ですか
gRNAのエンリッチ状況について、信頼性のある統計情報を算出するためには、レプリケートサンプルをご用意いただくことを推奨いたします。レプリケートが無い場合でも、解析を行うことは可能です。

Q：取得データ量（リード数）はどのように決めたら良いですか
1リードペア=1分子のPCR産物に相当し、「リードペア数/gRNAの種類数」がカバレッジとなります。
一般的に、CRISPRスクリーニング解析には×100～500カバレッジ程度の深度が推奨されております。
ライブラリに含まれるgRNAの種類数、およびご希望のカバレッジに応じて取得データ量（リード数）を ご選択ください。

（例）12万種類のgRNAライブラリについて平均100カバレッジとなるデータ量は、12万×100=1200万 リードペアとなります。

Q：PCR、精製について推奨の方法はありますか
本解析は、「16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina)」に沿って実施いたします。PCRおよび精製の方法につきましてはこちらのプロトコルをご参考いただき、詳細はお問い合わせください。

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