Illuminaアンプリコンシーケンス解析

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• ご利用例
• 解析プラン
• ご用意いただくサンプル
• 解析ワークフロー
• 標準データ解析
• オプションデータ解析

解析概要

Illuminaシーケンサーを使用してPCR産物のディープシーケンスを行い、配列の種類と割合を集計します。

ご利用例

• アプタマー探索
• ファージディスプレイ
• 遺伝子多型解析
• ゲノム編集領域の配列確認　など

• ※ CRISPRスクリーニング解析はこちらをご覧ください。

解析プラン

■ PCR産物のサイズ、必要リード数、解析目的によりシーケンス仕様をお選びください。

シーケンサー	NovaSeq	MiSeq
読み取り方法	Paired-End 150bp x 2	Paired-End 300bp x 2
データ取得量の単位	330万リードペア(1Gb) / 検体～	10万リードペア(60Mb) / 検体～
推奨インサートサイズ (対応可能インサートサイズ)	200bp～250bp （ 約 20 bp ～約 800 bp ）	250bp～450bp （ 約 20bp ～ 約 800bp ）
PCR産物(インサート) サイズについて	PCR産物サイズが推奨インサートサイズの範囲外であってもシーケンスは可能です。ただし、データ量保証の対象外とさせていただく場合がございますので、推奨範囲から大きく異なる場合は事前にご相談ください。 推奨インサートサイズよりも大きいPCR産物の場合、リード後半部のQV低下によりRead1/Read2のオーバラップが取り難くなります。Amplicon-SeqではRead1/Read2のオーバーラップを取ることでアンプリコン全長の配列を決定するため、解析上の有効リード数が減少しますのでご注意ください。

ご用意いただくサンプル

以下の条件をご確認の上、サンプルをご用意ください。

• 精製済みPCR産物の必要量：5ng（0.2ng/μL）以上
• 指定リンカー配列（下図参照）が付加されていること
• プライマーや非特異的産物の除去が行われていること

[アンプリコンの配列構造]

※リンカー配列・プロトコル詳細はお問い合わせください。

解析ワークフロー

標準データ解析

【リードカウント解析】
各検体でRead1-Read2 を連結し、アンプリコン全長の同一配列集計を行います。
[リードカウント結果]

【検体間比較テーブル作成】
各検体のリードカウント結果を統合し、検体間でカウント数を比較可能なテーブルを作成します。
[検体間比較テーブル]

オプションデータ解析

【ターゲット解析】
①解析対象領域の切り出し
アンプリコン全長の中から、解析対象領域の塩基配列を切り出し、配列を再集計します。 保存配列を除去することで、多型配列の集計結果が見やすくなります。
②アミノ酸への翻訳・集計
塩基配列をアミノ酸に翻訳し、アミノ酸配列のリードカウントを行います。
③アライメント作成
リードカウント後の塩基配列やアミノ酸配列について、カウント数上位の配列を対象としてアライメントを作成します。 リファレンスの配列を含めてアライメントを作成することもできます。

 

【塩基頻度集計】
リードデータを使用して、リファレンス配列上の1 塩基ごとに、塩基（Ａ・T・G・C）の頻度を算出します。
※ 変異間のフェージング情報は失われます。
［塩基頻度集計結果]

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