サンプル調製プロトコル

サンプル調製について

送付していただくサンプルに関しましては、事前にアガロースゲル電気泳動によるサンプルの状態、 濃度等の確認を行ってください。
サンプルの濃度が希薄である場合や分解が見られる場合等は、解析をお引き受けすることが困難と なりますので、ご理解、ご協力をいただけますと幸いです。
以下に推奨させていただくプロトコルを掲載いたしますので、ご参照ください。

サンプル調製方法

解析の成功率を上げるため、サンプルは市販の精製キットによる抽出・精製を行ってください。
特にPCR産物は、PCR反応後、未反応のプライマーやdNTP等の残存がございますと、
良好な解析結果が得られません。
弊社推奨精製キット: Labo Pass™ Productsシリーズ

なお、TE等のEDTA含有Bufferでサンプルを溶解させた場合、EDTAがサイクルシーケンス反応を阻害する恐れがございます。
サンプルおよびプライマーの調製には、 滅菌水を使用されることをお勧めしております。

■ワンパス・フルサービスの場合■

以下の濃度に従い、サンプル、プライマーを調製の上、必要量以上送付ください。

プラスミド・・・・・濃度100~300ng/μL、20μL以上
PCR産物・・・・・濃度10~50ng/μL、20μL以上
プライマー・・・・・濃度3.2μM 、必要量10μL以上

  • ※ サンプルを送付いただく際に送付時の蒸発等により体積がロスしてしまう恐れがございます。
    濃度が濃い場合でも、送付量は20μL 以上としていただけますようお願いいたします。
  • ※ 同じサンプルの複数解析をご希望の場合、解析数分のサンプルを1本のチューブにまとめて送付してください。
  • ※ ワンパスサービス(8連チューブ、プレート)で使用するプライマーは、原則として “8連チューブ1本または1プレートにつき2種類まで”とさせていただきます。
    3種類以上のプライマーを使用する場合、対応するプライマーをサンプルと同じく 整列・分注した専用のプライマーチューブまたはプレートの作成をお願いいたします。
    (1Wellあたり3.2μM、10μL以上のプライマーを入れてください)

■プレミックスサービスの場合■

お手持ちのサンプルおよびプライマーの濃度に従い、下記相当量をチューブに添加後、全量を20μLに調製し、全量を送付してください。

プレミックスの濃度調製
サンプル種別 サンプルサイズ サンプル必要量
プラスミド 450~900ng
PCR産物 100~200bp 3~10ng
200~500bp 10~30ng
500~1000bp 15~60ng
1000~2000bp 30~115ng
>2000bp 60~140ng
(例) : PCR産物 200~500bp 20ng
プライマー 10 pmol
滅菌水 (メスアップ)

total 20μL
  • ※ プレミックスサービスでは、ご提供サンプルを一律の使用量(弊社規定量)にて反応を実施いたします。
    濃度が大きく異なりますと良好な結果が得られない場合がございますので、必要濃度を上記表でご確認の上、サンプルをご用意ください。

サンプル濃度測定法について

シーケンスサンプルの濃度測定法は、Qubitまたはアガロースゲル電気泳動をお勧めしております。分光光度計での濃度測定は DNA以外の残存物等が含まれている場合、正確な測定が困難となります。(10倍以上濃度が異なる場合もございます。)

そのため、シーケンスサンプルの濃度は、Qubitで測定を行うか、アガロースゲル電気泳動を行い、濃度既知の分子量マーカー等と明るさを比較することにより測定してください。

濃度既知の分子量マーカーがお手元に無い場合は、目安としてサンプルを1μLアプライしていただき、はっきりとバンドが確認できる状態としてください。

なお、ご提供いただく電気泳動写真に関しましては、サンプルのアプライ量、マーカー情報(アプライ量や濃度等)を明記していただき、バンドがはっきり見えているもの以外はコピーではなく現物をご提供ください。

アガロースゲル電気泳動例

■プラスミドサンプルの場合■

1.0% アガロース、TAEバッファー、マーカー(200ng/μL調製済みプラスミドマーカー)使用。マーカー、サンプルは各1.0μLをアプライ。

M 200ng
1μL
Sample1
1μL
Sample2
1μL
Sample3
1μL
M = plasmid marker

上記の写真をもとに、各サンプル濃度を見積もると、以下のとおりとなります。

Sample 1:約150ng/lane (150ng/1μL)
Sample 2:約400ng/lane (400ng/1μL)
Sample 3:約400ng以上/laneですが、飽和しているためサンプル希釈後に、再度電気泳動を行うことをお勧めします。

アガロースゲル電気泳動の結果、RNAの混入が確認された場合は、RNase処理等でRNAを除去されることをお勧めいたします。過度のRNAの混入は、シーケンス反応を阻害する場合があります。

<RNAが過度に混入している場合の電気泳動結果>
←RNA

■PCR産物の場合■

2.0%アガロース、TAEバッファー、マーカー(タカラバイオ社100bp DNA Ladder)使用。
マーカー4.0μL、サンプルは各1.0μLをアプライ。

  • ※ 各バンドのDNA量が調製されたマーカーとなります。
    弊社では4μLアプライ時、各バンドが約20ng相当となるように調製し使用しております。
M Sample1 Sample2
4μL 1μL 1μL
M = 100bp DNA Ladder

上記の写真をもとに、各サンプル濃度を見積もると、以下のとおりとなります。

Sample 1は15ng/lane(15ng/μL)
Sample 2は 60ng以上/lane

アガロースゲル電気泳動の結果、バンドが複数本見られる場合や、プライマーの除去が不完全と考えられるバンドが見られる場合は、良好なデータを得ることが困難です。
この場合、ゲルからの切り出し精製、またはプライマーの除去を再度行ってください。

<プライマーの残存が見られる電気泳動結果>
←プライマー

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