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(シーケンスサービス共通)
サンプル調製プロトコル ユニバーサルプライマーリスト  
FAQ

■サンプル調製について
サンプル調製方法 サンプル濃度測定法 アガロースゲル電気泳動例 サンプル送付量
  送付していただくサンプルに関しましては、事前にアガロースゲル電気泳動によるサンプルの状態、
濃度等の確認を行ってください。
サンプルの濃度が希薄である場合や、分解が見られる場合等は、解析をお引き受けすることが困難と
なりますので、ご理解、ご協力をいただけますと幸いです。
以下に推奨させていただくプロトコルを掲載いたしますので、ご参照ください。

サンプル調製方法
解析の成功率を上げるため、サンプルは市販の精製キットによる抽出・精製を行ってください。
特にPCR産物は、PCR反応後、未反応のプライマーやdNTP等の残存がございますと、
良好な解析結果が得られません。
弊社推奨精製キット: Labo Pass™ Productsシリーズ

なお、TE等のEDTA含有Bufferでサンプルを溶解させた場合、EDTAがサイクルシーケンス反応を阻害
する恐れがございます。
サンプルおよびプライマーの調製には、 滅菌水を使用されることをお勧めしております。

■プレミックスサービスの場合■
(1) 以下の濃度でサンプル、プライマーの濃度調整をお願いいたします。

プラスミドサンプルの場合
サンプルサイズ サンプルの必要濃度
2〜4kbp 0.2μg/μL = 200ng/μL
6kbp 0.3μg/μL = 300ng/μL
8kbp 0.4μg/μL = 400ng/μL
10kbp 0.5μg/μL = 500ng/μL
 
PCR産物の場合
サンプルサイズ サンプルの必要濃度
100〜500bp 10ng/μL
500〜1,000bp 10〜20ng/μL
1,000〜2,000bp 20〜40ng/μL
2,000bp以上 40〜100ng/μL

プライマー:3.2μM〜5μMに調製

(2)  上記表の濃度に調整したサンプルおよびプライマーを、1:1の混合率で、
1解析(1チューブもしくは 1well)につき、この混合液を作製してください。

(例) : プラスミドDNA 2〜4kbp :0.2μg/μL=200ng/μLのサンプル5μL+プライマー
3.2μMのものを5μL → total 10μL
※ 上記規定の濃度より薄くなってしまう場合がございましたら別途お問い合わせください。

(3) 調製した混合液を1解析あたり10μL 以上送付してください。


■ワンパスサービス、フルサービスの場合■
(1) 以下の濃度でサンプル、プライマーの濃度調整をお願いいたします。
サンプル : 上記表をご参照ください。
プライマー : 10μM に調製

(2) 上記表の濃度に調整したサンプルおよびプライマーを1解析あたり各10μL 以上送付してください。
サンプルを送付いただく際に送付時の蒸発等により体積がロスしてしまう恐れがございます。
濃度が濃い場合でも、送付量は10μL 以上としてくださいますようお願いいたします。
同じサンプルで複数解析をご希望の場合、解析数分のサンプルを1本のチューブにまとめて送付してください。
サンプル濃度が上記表に記載された濃度に満たない場合は、事前にご相談の上、多目に送付してください。 


サンプル濃度測定法について
シーケンスサンプルの濃度測定法は、アガロースゲル電気泳動をお勧めしております。
分光光度計での濃度測定は DNA以外の残存物等が含まれている場合、正確な測定が困難となります。(10倍以上濃度が異なる場合もございます。)

そのため、シーケンスサンプルの濃度は、アガロースゲル電気泳動を行い、濃度既知の分子量マーカー等と明るさを比較することにより測定してください。

濃度既知の分子量マーカーがお手元に無い場合は、目安としてサンプルを1μLアプライしていただき、はっきりとバンドが確認できる状態としてください。

なお、ご提供いただく電気泳動写真に関しましては、サンプルのアプライ量、マーカー情報(アプライ量や濃度等)を明記していただき、バンドがはっきり見えているもの以外はコピーではなく現物をご提供ください。

アガロースゲル電気泳動例
■プラスミドサンプルの場合■
1.0% アガロース、TAEバッファー、マーカー(200ng/μL調製済みプラスミドマーカー)使用。
マーカー、サンプルは各1.0μLをアプライ。
 
M 200ng
1μL
Sample1
1μL
Sample2
1μL
Sample3
1μL
 
濃度見積り例 M = plasmid marker
上記の写真をもとに、各サンプル濃度を見積もると、以下のとおりとなります。
  Sample 1: 約150ng/lane (150ng/1μL)
  Sample 2: 約400ng/lane (400ng/1μL)
  Sample 3: 約400ng以上/laneですが、飽和しているためサンプル希釈後に、再度電気泳動を行うこと
        をお勧めします。
アガロースゲル電気泳動の結果、RNAの混入が確認された場合は、RNase処理等でRNAを除去されることをお勧めいたします。
過度のRNAの混入は、シーケンス反応を阻害する場合があります。
<RNAが過度に混入している場合の電気泳動結果>
RNA混入の例←RNA
■PCR産物の場合■
2.0%アガロース、TAEバッファー、マーカー(タカラバイオ社100bp DNA Ladder)使用。
マーカー4.0μL、サンプルは各1.0μLをアプライ。
※ 各バンドのDNA量が調製されたマーカーとなります。
   弊社では4μLアプライ時、各バンドが約20ng相当となるように調製し使用しております。
 
M Sample1 Sample2
4μL 1μL 1μL
濃度測定の例 M = 100bp DNA Ladder
上記の写真をもとに、各サンプル濃度を見積もると、以下のとおりとなります。
  Sample 1は15ng/lane(15ng/μL)
  Sample 2は 60ng以上/lane
アガロースゲル電気泳動の結果、バンドが複数本見られる場合や、プライマーの除去が不完全と
考えられるバンドが見られる場合は、良好なデータを得ることが困難です。
この場合、ゲルからの切り出し精製、またはプライマーの除去を再度行ってください。
<プライマーの残存が見られる電気泳動結果>
 
プライマーの混入の例 ←プライマー

サンプル送付量
サンプルのサイズにより、1回のシーケンス反応に必要となるサンプル量が異なります。
以下の表を参考とし、サンプル調製を行ってください。
また、サンプルを送付いただく場合、送付時の蒸発等により体積がロスしてしまう恐れがございます。
濃度が濃い場合でも、送付量は10μL以上としていただけますよう、お願いいたします。

同じサンプルで複数解析をご希望の場合、解析数分のサンプルを1本のチューブにまとめて
送付してください。
※サンプル濃度が下記表に記載された濃度に満たない場合は、事前にご相談の上、多目に
  送付してください。

プラスミドサンプルの場合
サンプルサイズ サンプルの必要濃度
2〜4kbp 0.2μg/μL = 200ng/μL
6kbp 0.3μg/μL = 300ng/μL
8kbp 0.4μg/μL = 400ng/μL
10kbp 0.5μg/μL = 500ng/μL
 
PCR産物の場合
サンプルサイズ サンプルの必要濃度
100〜500bp 10ng/μL
500〜1,000bp 10〜20ng/μL
1,000〜2,000bp 20〜40ng/μL
2,000bp以上 40〜100ng/μL
プライマー:1解析あたり10μM程度で、10μL以上を送付してください。

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