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■解析フロー
■ ゲノムシーケンス解析
DNAシーケンス解析
 
解析概要
ゲノムDNAを超音波により断片化し、得られたDNA断片の両端にアダプターをライゲーションします。
アセンブル解析や、リシーケンス変異検出に用いるシーケンスデータを取得します。

 
  【 PCR Freeのライブラリ調製 】
TruSeq DNAライブラリ調製キットには、アダプター付与後にPCR増幅を行う方法と、PCR増幅を行わず最終ライブラリとする方法 (PCR-Free)があります。
PCR工程を含むキットでは、PCR-Freeの調製に比べて少ないDNAサンプルからライブラリを作製することができます。
(下記、サンプル必要量参照)
一方、PCRを行うと、ライブラリ中でPCR増幅効率のバイアスが生じ、ゲノム上でGC含量の高い領域等、配列構造によってはカバレッジが少なくなる可能性があります。また、リシーケンスで変異頻度を重視する解析の場合、PCR duplicateにより生じたリードが存在すると、正確な変異頻度を算出することが難しくなるため、PCR-Freeの使用を推奨しております。
 
サンプル必要量
DNA-Seq(PCR-Plus)
精製済みゲノムDNA : 1μg(40ng/μl)以上
DNA-Seq(PCR-Free)
精製済みゲノムDNA : 5μg(40ng/μl)以上
Nuclease Free Waterに溶解してください。
分光光度計での濃度測定は、遊離のヌクレオチド等の夾雑物を検出し、正確な値が出ない可能性がありますので、アガロースゲル電気泳動での既知濃度のDNAとのバンドの蛍光強度比較に基づく測定を推奨しております。

取得データ量の目安
De novoアセンブル解析では、ゲノムサイズの
200×以上のデータ取得を推奨しております。
リシーケンス変異解析の内、germline mutationの検出にはゲノムサイズの30×以上のデータ取得を目安としております。somatic mutation等、低頻度変異の解析では、対象の変異頻度を想定した上で、その変異がシーケンスエラーと区別できる程度のカバレッジが得られるデータ量を取得する必要があります。
メイトペアシーケンス解析
  解析概要
数Kbの長いゲノム断片(インサート)の両末端に相当する配列を含むシーケンスライブラリを作製します。
得られたメイトペアリードは、通常のペアエンドリードと合わせてアセンブル解析に使用されます。

サンプル必要量
・精製済みゲノムDNA : 10μg(200ng/μl)以上
※Nuclease Free Waterに溶解してください。
【 ゲノムアセンブル解析 】
De novoアセンブル解析では、インプットのデータ量が多い程、アセンブル効率が上がりますが、
一種類のインサートサイズのペアエンドリードデータのみではカバレッジを増加しても繋がらない
ゲノム配列構造の領域もあります。
インサートサイズの異なるメイトペアリードのデータを加えることで、そのような領域のスキャフォールディングが行われ、アセンブル効率が向上します。
ChIPシーケンス解析
 
解析概要
ChIP処理を行ったゲノムDNA断片にアダプターを付与し、ライブラリを作製します。
得られたシーケンスリードをゲノムにマッピングし、対象因子が結合していたゲノム領域を検出することができます。

  【 コントロールサンプルについて 】
IPを行わないDNAサンプル(input)のシーケンスデータを取得した場合、inputサンプルのマッピング結果をバックグラウンドとして、IPサンプルのマッピング結果を補正することで、ピーク検出の特異性が向上します。
 
【 断片化について 】
ChIP-DNAサンプルの断片配列長は、130〜180bpとなるようご用意ください。DNA断片のサイズが大きい場合には、更に断片化処理を行ってからライブラリ作製を行いますが、IP処理時に該当サイズまで断片化が行われた場合に比べ、検出されるピーク領域がbroadになることが考えられます。
 
サンプル必要量
  精製済みChIP-DNA : 50ng(10ng/μl)以上
サイズレンジ:130〜180 bp
Nuclease Free Waterに溶解してください。
分光光度計では正確な測定ができない可能性
があるため、市販の2本鎖DNA定量キット
(Qubit fluorometer、Invitrogen社 Quant-iT
dsDNA kit等)での測定を推奨しております。
■ ターゲットシーケンス解析
  ● ターゲットシーケンス
  ゲノムサイズの大きい高等生物でも、解析対象のゲノム領域を限定することにより、比較的少ない
データ量で変異解析を行うことができます。
ターゲット解析の手法としては、(1) 対象領域をPCRで増幅する方法、(2) ゲノムDNAを断片化した後、キャプチャプローブで対象領域を濃縮する方法があります。
エクソーム解析(Agilent SureSelect)
解析概要
  ゲノムDNAを断片化し、アダプターを付加した後、エクソン領域をキャプチャするオリゴプローブを用い、エクソン領域のDNA断片を濃縮します。Agilent SureSelectでは、[ Human・Mouse・Bovine・Zebrafish ] のエクソーム解析に対応した既製のデザインがあります。その他の生物種についてもカスタムキットを使用して設計することが可能です。
 
サンプル必要量
精製済みゲノムDNA:5μg(40ng/μl)以上
Nuclease Free Waterに溶解してください。
分光光度計での濃度測定は、遊離のヌクレオチド等の夾雑物を検出し、正確な値が出ない可能性がありますので、アガロースゲル電気泳動での既知濃度のDNAとのバンドの蛍光強度比較に基づく測定を推奨しております。
 
取得データ量の目安
  SureSelectを使用したエクソーム解析では、ターゲットの8割以上の領域で20×以上のカバレッジが見込まれる程度のデータ取得を目安としてご案内しております。低頻度変異(somatic mutation等)の解析では取得データ量を更に増加することをお勧めいたします。
カスタムターゲットシーケンス
下記のキットを使用して、任意のゲノム領域を対象としたカスタムパネルを作製することができます。
※デザインに関しては、キット販売元のメーカーにお問い合わせください。
ターゲットシーケンス 既製パネル
ヒトのがんや疾患に関連する遺伝子をターゲットとした既製のパネルです。
アンプリコンを使用した変異解析
● 対象領域が10kb程度の場合
  ターゲット領域の全長が10 kb程度である場合、該当領域をカバーする数Kbずつのアンプリコンをサンプルとして、ホールゲノム解析と同様のライブラリ調製(アンプリコンの断片化、アダプター付加)を行い、ターゲット領域のシーケンスデータを得ることができます。データ解析では、対象領域のリファレンス配列に対してリードをマッピングし、変異検出を行います。
ターゲットの例
数個の遺伝子のcDNA全長配列
1つの遺伝子のエクソン・イントロンを含むゲノム配列
 
● 対象領域が 〜500bp程度の場合
特定のゲノム領域について、サンプルに含まれる多型配列の種類や存在割合を調べることを目的とする場合には、該当領域 〜500bp程度のアンプリコンをサンプルとして、配列全長のシーケンス解析を行うことが可能です。
アンプリコンシーケンス解析についてはこちらをご参照ください
 
ターゲットの例
遺伝子の一部領域の体細胞変異解析
TCR遺伝子, BCR遺伝子の多型解析
ゲノム編集領域
ウイルスの多型領域
■トランスクリプトーム解析
RNAシーケンス解析
解析概要
  mRNAを断片化、逆転写して得られたcDNA断片の両端にアダプターを付加します。発現解析や、De novoトランスクリプトーム解析に用いるシーケンスデータを取得します。
 
サンプル必要量
mRNA-Seq
精製済みTotal RNA : 5μg(40ng/μl)以上
精製済みmRNA : 200ng(10ng/μl)以上
Ribo-Zero + mRNA-Seq
精製済みTotal RNA : 10μg(40ng/μl)以上
Nuclease Free Waterに溶解してください。
 
【 ストランド情報を維持したライブラリ 】
TruSeq stranded RNAライブラリ調製キットでは、元のRNAの転写方向性を維持したリードデータが得られます。mRNAの逆転写により1st鎖cDNAを合成した後、2nd鎖cDNA合成時に、dTTPではなく、dUTPを使用することで、最終工程のPCRにおいて2nd鎖cDNAの増幅が抑制されます。(右図参照) その結果、リードデータのほとんどが1st鎖cDNA由来となります。
リードのストランド情報を利用して、マッピングやアセンブル解析の精度を高めることができるため、stranded RNAライブラリ調製キットの使用をお勧めしておりますが、過去に行われたシーケンス解析と条件を揃えたい場合等、ストランド情報の無いライブラリ調製キットを使用することも可能です。
 
【 rRNA除去方法について 】
● バクテリア
バクテリアのRNA-Seq解析では、Total RNAサンプルに対し、rRNAキャプチャ除去キット「Ribo-Zero」を使用したrRNA除去を行います。
● 真核生物
真核生物のRNA-Seqライブラリ調製では、一般的にoligo-dTビーズを用いたpoly(A)-RNAの精製を行います。
poly(A) tailを持たない一部のlong non coding RNAを解析対象とする場合には、poly(A)-RNA精製ではなく、rRNAキャプチャ除去キット「Ribo-Zero」を使用したrRNA除去を行うことも可能です。
■ Ribo-Zero rRNA Removal Kits 対応生物種については、こちらご参照ください

また、RNAの分解が進んだサンプルでは、poly(A)-RNA精製を行うことで、mRNAの3’側に偏ったデータ
となる可能性があるため、Ribo-Zeroを用いたrRNA除去に変更することも可能です。
■ ヒト由来サンプルの場合は、こちらをご参照ください
【 トランスクリプト配列決定 】
ゲノムの解読されていない生物等で、網羅的なトランスクリプト配列決定を目的とした場合(発現定量を行わない場合)は、複数組織由来のRNAを混合したサンプルを用いることで、各組織で特異的な発現プロファイルが均一化されたデータが得られます。
【 微量RNAサンプルを用いた解析 】
数細胞由来の微量Total RNAを用いたRNA-Seq解析では、cDNAの増幅を行う必要があります。
quartz-Seq法(Sasagawa et al., 2013)は、 @ 逆転写時のアニール温度の最適化、 A cDNA増幅に使用するPCR酵素の選定、 B PCR時にプライマーダイマー等の短い非特異産物の増幅を抑制するプライマーを用いることで、増幅バイアスが少なく検出感度の高いRNA-Seqを行う手法とされています。
【 解析対象のRNAサイズ 】
RNA-Seq用ライブラリ調製では、ビーズ精製工程にて低分子が除去されるため、100 bp以下の短い
RNAは解析対象から除外されます。small RNAを対象とした解析については、別途、small RNA-Seq用ライブラリを調製する必要があります。
■ small RNA-Seq用ライブラリ調製については、こちらをご参照ください
【 ヒトFFPEサンプルを用いた解析 】
TruSeq RNA accessキットでは、ヒトのコード領域をキャプチャするプローブを用い、poly(A)に依存しないmRNA精製を行い、分解の進んだ少量のTotal RNAからRNA-Seq用ライブラリを作製することが可能です。
なお、分解の度合いによっては、品質の高いRNAサンプルを使用した解析に比べ、マッピング結果や、その後の発現解析、融合遺伝子解析の精度が劣る場合がございます。
small RNA シーケンス解析
 
解析概要
TruSeq small RNAライブラリ調製キットでは、Total RNAをサンプルとして、small RNAに対するアダプター付加と、PAGE・切り出し精製によるサイズセレクションを行い、small RNA由来配列のシーケンスライブラリを作製します。リード1本がsmall RNA 1本に相当し、同一配列の集計を行うことにより、各small RNAの相対的な存在量を算出できます。

【 解析対象のsmall RNA 】
TruSeq small RNAライブラリ調製キットで用いられる3’アダプターは、生体内でRNAプロセシングを受けたsmall RNA(Dicerにより切断されたmiRNA等)の末端に見られる3’- OHに結合します。
そのため、機能的small RNA以外のRNA分解産物等はライブラリ化されず、Total RNAサンプルから効率良くmiRNAをライブラリ化することができます。
 
サンプル必要量
small RNA-Seq
精製済みTotal RNA : 5μg(200ng/μl)以上
精製済みsmall RNA : 200ng(10ng/μl)以上
Nuclease Free Waterに溶解してください。
PAGE・切り出し精製では、通常22-30 nt相当のsmall RNA配列を抽出しますが、解析対象とされるsmall RNAのサイズにより、切り出しサイズを変更することも可能です。
■16S rRNA 細菌叢解析
16S rRNA 細菌叢解析
 
解析概要
土壌や糞便等の環境サンプルから抽出したメタゲノムDNAをテンプレートとして、バクテリア16S rRNA領域のアンプリコン(約450bp)を作製します。アダプター配列が付加されたプライマーを用い、PCRによるライブラリ調製を行います。
MiSeq 300bpペアエンドシーケンスで、アンプリコン配列全長を決定し、菌叢解析に使用するデータを取得します。

サンプル必要量
精製済み1st PCR産物 : 5ng(0.2ng/μl)以上(オーバーハング配列を含むアンプリコンサイズ:約550 bp)
精製済み2nd PCR産物 : 150ng(5ng/μl)以上(アダプター配列を含むアンプリコンサイズ:約630 bp)
10mM Tris pH8.5 Buffer、またはNuclease Free Waterに溶解してください。
分光光度計での濃度測定は、遊離のヌクレオチド等の夾雑物を検出し、正確な値が出ない可能性がありますので、アガロースゲル電気泳動での既知濃度のDNAとのバンドの蛍光強度比較に基づく測定を推奨しております。
 
16S rRNAターゲット領域
  バクテリア16S rRNA V3-V4領域を対象としたプライマーセットをご提供いたします。
プライマー配列の詳細については、Illumina社公開資料 「16S Metagenomic Sequencing Library Preparaion」にてご確認ください。
本プライマーセットは、バクテリア16S rRNA解析用であり、アーキアの16S rRNAには対応しておりません。
本プライマーで増幅され得る菌種の詳細は、RDPのProbe Match にてご確認ください。
【 植物由来配列の混入について 】
植物が混入する可能性のあるサンプルでは、植物細胞の葉緑体、ミトコンドリア由来の16S rRNA配列が多量にデータに含まれる可能性があります。
データ解析時に、植物由来と推定された配列を除外することも可能ですので、事前にご相談ください。
本解析は、Illumina社公開資料「16S Metagenomic Sequencing Library Preparation」に従い
実施しております。
ライブラリ調製の詳細プロトコルに関しましては、弊社注文書 (16S群集解析あいのりプラン)内、プロトコルシートをご参照ください。
■アンプリコンシーケンス解析
アンプリコンシーケンス解析
解析概要
  500 bp程度のアンプリコンを対象としたディープ
シーケンスを行います。
ゲノム編集領域や、細胞・ウイルス集団内の
多型領域を対象とした解析では、得られたアンプ
リコン配列を集計し、配列多型の種類と存在割合
を算出できます。
また、rRNAやITS領域等、マーカー遺伝子を
用いた生物叢解析に使用するデータを取得する
こともできます。
16S rRNA細菌叢解析については、
こちらをご参照ください
 
サンプル必要量
  精製済み1st PCR産物 : 5ng(0.2ng/μl)以上
精製済み2nd PCR産物 : 150ng(5ng/μl)以上
10mM Tris pH8.5 Buffer、またはNuclease Free Waterに溶解してください。
分光光度計での濃度測定は、遊離のヌクレオチド等の夾雑物を検出し、正確な値が出ない可能性がありますので、アガロースゲル電気泳動での既知濃度のDNAとのバンドの蛍光強度比較に基づく測定を推奨しております。
 
アンプリコンの構造
  指定のオーバーハング配列を付与したプライ
マーをご用意いただき、アンプリコンを作製して
ください。

【 インサート配列の塩基長について 】
MiSeq 300 bpペアエンドシーケンス解析において、アンプリコンシーケンスの乗り合い解析を行っております。最大550 bp程度のインサート配列を読むことができますが、リードの後半にかけてシーケンスクオリティが低下する可能性を考慮し、〜500 bp程度のインサートサイズを推奨しております。また、乗り合い解析では塩基長が極端に異なるライブラリを同時に解析した場合、双方のデータに悪影響(一方のデータ量が極端に少なくなる等)が出る可能性があるため、アンプリコンサイズは450〜500 bp程度となるよう設計をお願いしております。
上記よりも短い、または長いサイズのアンプリコンを対象とした解析に関しては、他のシーケンス解析プランもございますので、ご相談ください。
 
本解析は、Illumina社公開資料「16S Metagenomic Sequencing Library Preparation」に従い
実施しております。
オーバーハング配列、および、ライブラリ調製の詳細プロトコルに関しましては、弊社注文書
(Amplicon Deep Sequence 解析)内、プロトコルシートをご参照ください。
■ PacBio RS U
DNA-Seq
ゲノムDNAをサンプルとしてシーケンスを
行い、アセンブル解析に用いるデータを取得します。

※ 上記、アセンブル結果は、目安であり保証値ではありません。
  ゲノムの品質や、配列構造によりアセンブルの効率は異なります。

サンプル必要量
  精製済みゲノムDNA:20μg(150ng/μl)以上
Nuclease Free Waterに溶解してください。
分光光度計での濃度測定は、遊離のヌクレオチド等の夾雑物を検出し、正確な値が出ない可能性がありますので、アガロースゲル電気泳動での既知濃度のDNAとのバンドの蛍光強度比較に基づく測定を推奨しております。
 
推奨のゲノム抽出キット
  Qiagen® MagAttract® HMW kit
Qiagen Genomic-tip kit
Qiagen Gentra® Puregene® kit
 
サンプルの注意事項
  @ 二本鎖DNAであること。一本鎖DNAでのライブラリ調製はできません。
A 複数回の凍結融解を経ていないこと。
B OD260/280の比が1.8から2.0であること。
C 不溶物を含まないこと。
D RNA混入が無いこと。
E 挿入蛍光色素、又は紫外線放射に曝されていないこと。
F キレート剤(EDTA)、二価金属カチオン(Mg2+)、変性剤(グアニジ ン塩、フェノール)、または浄化剤(SDS、Triton-X100)などが含まれていないこと。
G 組織(ヘム、フミン酸、ポリフェノール、多糖類など)のキャリー・オーバーコンタミネーションが
ないこと。
Iso-Seq
mRNA をサンプルとしてシーケンスを行い、トランスクリプト配列決定に用いるデータを取得します。
 
サンプル必要量
  精製済みTotal RNA:10μg(50ng/μl)以上
( RIN値 8以上・OD260/280値 1.8 - 2.0以上)
Nuclease Free Waterに溶解してください。
濃度測定については基本的に分光光度計で問題ございませんが、可能であればAgilent2100BioAnalyzer等での事前確認を行っていただくことを推奨しております。
 
解析セル数の目安
  多様なインサートサイズのライブラリが混在している場合、SMRT cellには短いライブラリが優先的にロードされます。
そのため、Iso-Seq解析では、mRNAのサイズでライブラリを分割し(1-2 kb, 2-3 kb, 3-6 kb, >6 kb等)、各サイズ分画2セル程度でシーケンスを行います。
解析対象の遺伝子が限定されている場合、該当mRNAを含むサイズ画分のみシーケンスを行うことも可能です。
PacBioではライブラリサイズによりシーケンス量にバイアスが出るため、遺伝子発現量の算出はできません。
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