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■ 次世代シーケンス概要
■ Illumina HiSeq / MiSeq
■ PacBio RS U
■ 次世代シーケンス概要
次世代シーケンス概要
弊社では、次世代シーケンサー Illumina社 「HiSeq2500」 ・ 「MiSeq」 ・ 「HiSeq4000」 ・ 「HiSeqX」 およびPacific Biosciences社 「PacBio RSU」 を用いた高速DNAシーケンスを実施いたします。
ランあたり最大1Tbpと圧倒的なデータ産出量を誇るHiSeq2500、読み取り長・データ取得量のバランスが
優れたMiSeq、10Kb以上の平均リード長を得られるPacBio RSU等から解析目的に合わせた選択が可能
です。

細かなニーズにあわせたライブラリ調製サービス・データ解析サービスも充実!
ご要望に従い最適なプランをご提供いたします。
■ Illumina HiSeq / MiSeq
Illumina シーケンサー
 
Illumina HiSeq 2500
  100bp程度のショートリードデータを、1ランで
最大1Tb出力します。
マルチプレックス解析により、サンプルあたり
任意のデータ量を取得することが可能です。
 
Illumina MiSeq
  300bpペアエンドシーケンスでは、〜500 bp
程度のインサート配列全長決定が可能です。
16S rRNA等アンプリコンを対象とした解析に
適しています。
 
Illumina HiSeq 4000 ・ HiSeq X
  高密度のクラスターを形成するフローセルで、
より高いスループットの出力が可能です。
多くのデータを必要とする、高等動物の
全ゲノム解析や、多検体のエクソーム解析
に使用されます。
HiSeqXはホールゲノム解析に限定した
システムです。
Illumina HiSeqからロングリードが登場! 詳しくは、こちらをご参照ください


※1 上記は、弊社にて現在主に使用している試薬バージョンとなります。
市販されている他の試薬バージョンの取扱いについては、お問い合わせください。
※2 「リード数」は、ペアエンドシーケンス解析のリードペア数となります。
※3 「データ量」は、ペアエンドシーケンス解析時の塩基数を示します。
※4 取得データ量(リード数)は弊社実測に基づく参考値であり、Illumina社カタログスペックとは異なる場合があります。 また、保証値ではございません。
※5 HiSeq 100bpペアエンド解析については、サンプルあたりGb単位でのご依頼を承っております。 他のリード長の解析プランについては、お問い合わせください。
マルチプレックス解析
  アダプター配列には、サンプル識別用
のインデックス配列が含まれており、
1つのレーンで複数のサンプルを混合
してシーケンスすることができます。
(マルチプレックス解析)
出力されたリードデータは、インデック
ス配列に従い、サンプル毎に振り分け
られます。
シーケンスの原理
ゲノムDNA、RNA、アンプリコン等に由来するDNA断片を作製し、アダプターを付加します。
アダプター配列を介して、ライブラリをフローセル上に結合し、クラスター(同一ライブラリの集合)を形成します。各クラスターにて、1塩基伸長と蛍光読み取りのサイクルを繰り返し行うことで、フローセル上で並列的な大量シーケンスが行われます。

リードの読み取り
 
リード1、リード2、インデックスの配列は、それぞれ異なるシーケンスプライマーにより読み取られます。
同一クラスター由来のリード配列とインデックス配列が、データ上で関連付けられて出力されます。
 
  (1) Sequence Primer 1を用いて、
リード1配列をシーケンス
 
・ P5, P7:フローセル上での結合・増幅に使用される配列
・ SP1, SP2:シーケンスプライマーが結合する配列
・ i7:マルチプレックス解析用のインデックス配列
(2) Index Sequence Primerを用いて、
インデックス配列をシーケンス
(3) テンプレートの相補鎖を合成し、
Sequence Primer 2を用いて、
リード2配列をシーケンス
■ PacBio RS U
PacBio シーケンサー
 
PacBio RS IIでは、数kbのロングリードデータを出力します。
ライブラリ調製時にPCRを行わないため、GC含量に関わらず、均一なシーケンスデータを取得することができます。
バクテリア等ゲノムサイズの小さい生物種のゲノムアセンブル解析や、高等生物の完全長トランスクリプト配列決定に適しています。
シーケンス解析の原理
  ゲノムDNA断片、又は、全長mRNA由来のcDNAをインサートとして、両末端にヘアピン型のアダプターを付加し、環状のライブラリ(SMRT bellライブラリ)を作製します。
ライブラリのアダプター部分にプライマーとポリメラーゼを結合させ、SMRT cell にアプライします。
SMRT cell にはZMWと呼ばれる約15万個の孔が開いており、1個のZMWの底面に1分子のDNA-ポリメラーゼ複合体が固定されます。
1塩基伸長反応の際に塩基毎に標識された蛍光が検出され、環状のライブラリを繰り返し周回する様にシーケンスが行われます。
1個のZMWから1本のポリメラーゼリードデータが得られ、そこからアダプター配列を除いたサブリード配列を以降の解析に使用します。

取得データ量
 
PacBioでは、1 SMRT cell あたり300Mb〜1 Gbの
データが得られます。
サンプルの品質や配列構造により、取得データ量、
リード長は変動するため、下記の数値は参考値と
なります。

※ 上記は弊社実測に基づく参考値であり、保証値ではありません。


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