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次世代シーケンス概要

北海道システム・サイエンスでは次世代シーケンサーIllumina社「HiSeq2500」・「MiSeq」、Pacific Biosciences社「PacBio RSU」を用いた高速DNAシーケンスを実施いたします。
ランあたり最大1Tbpと圧倒的なデータ産出量を誇るHiSeq2500、読み取り長・データ取得量のバランスが優れたMiSeq 、10Kb以上の平均リード長を得られるPacBio RSUの3機種から解析目的に合わせた選択が可能です。

細かなニーズにあわせてライブラリ調製サービス・データ解析サービスも充実!
ご要望に従い最適なプランをご提供いたします。
  イルミナ社より Certified Service Provider の認定を取得しました。厳しい審査とトレーニングを経て認証されたCSPro認証受託サービスを是非ご利用ください!
詳しくは、イルミナ「イルミナ認証プログラムCSPro」のページをご覧ください
機器のご紹介
■Illumina HiSeq / MiSeq
【Illumina HiSeq 2500】
  1ランあたり最大1Tb (125bp×80億リード)
のデータを産出します。
2つのモード(High Output/ Rapid Run)が
あり、必要なデータ量に応じてご依頼いただ
けます。

<使用例>
・高等生物の全ゲノムドラフト解析
・ターゲット領域シーケンス解析
・トランスクリプトーム解析    等

クリックすると大きい画像が表示されます。
【Illumina MiSeq】
  1ランあたり最大15Gb (300bp×5000万リード)
のデータを取得することができます。

<使用例>
・微生物の全ゲノム配列決定
・アンプリコンシーケンス解析  等

  1ランあたりの解析総塩基数(最大のレーン数・フローセル数で稼動した場合)

Illumina HiSeq2500 High Output Mode Rapid Run Mode
V3試薬 V4試薬
リード長 50bp 100bp 125bp 50bp 100bp 150bp 250bp
リード数 シングルリード 〜30億 〜40億 〜6億
ペアエンド 〜60億 〜80億 〜12億
データ量 シングルリード 135-150Gb 270-300Gb 450-500Gb 25-30Gb 50-60Gb 75-90Gb 125-150Gb
ペアエンド 270-300Gb 540-600Gb 900-1Tb 50-60Gb 100-120Gb 150-180Gb 250-300Gb

Illumina MiSeq V2試薬 V3試薬
リード長 50bp 150bp 250bp 75bp 300bp
リード数 シングルリード 〜1500万 - -
ペアエンド - 〜3000万 〜5000万
データ量 シングルリード 750-850Mb - -
ペアエンド - 4.5-5.1Gb 7.5-8.5Gb 3.3-3.8Gb 13.2-15Gb
  ※ 取得データ量はカタログスペック最大値で保証値ではございません。
  サンプル・配列などにより変動しますので、詳細はお問い合わせください。
  ■解析原理はこちら



  ■PacBio RSU

最大 40Kb以上、平均 10Kb以上のロングリード配列の
シーケンスが可能です。

<使用例>
・ゲノム配列の決定(バクテリア、カビ、植物等)
・トランスクリプトーム配列の決定(ISO-Seq)
 ※ Iso-Seq は発現解析はできません。

P6-C4試薬
  最大リード長:40Kb以上
  平均リード長:10Kb以上
  1SMRT Cellあたりのデータ量 : 300Mb-1Gb
 
※ 取得データ量はカタログスペック最大値で保証値では
  ございません。
  サンプル・配列などにより変動しますので、詳細は
  お問い合わせください。


■解析原理はこちら



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次世代シーケンス解析原理
■Illumina HiSeq 2500 / MiSeq 解析原理
  ご提供頂いたゲノムDNAサンプルより、ゲノムDNAのランダムな断片を調製し(※)、両端に2種類のアダプターを付加します。 DNA断片はアダプター配列を利用してフローセル上に結合・増幅され、クラスター(同一DNA断片の集合)を形成します。シーケンスプライマーを添加後、1塩基伸長と蛍光の読み取りのサイクルを繰り返し行う事で、フローセル上で並列的な大量シーケンスを行います。

※ゲノム:物理的断片化, 350 / 550bp
 mRNA:化学的断片化ののち,
 ランダムプライマーによる逆転写,100bp-


クリックすると大きい画像が表示されます。
  ●シングルリード法
シングルリード法は、DNA断片の片側一定長(50〜300bp)を読み取る方法です。small RNA解析やChIP解析に有用です。

クリックすると大きい画像が表示されます。
●ペアエンド法
ペアエンド法は、DNA断片の両末端の各一定長(50〜300bp)を読み取る方法です。シングルリード法と比較して2倍の配列データが得られ、且つDNA断片の両末端のデータが得られる為、de novoアセンブルでのコンセンサス配列決定・マッピングでの構造変異解析などに有効です。

●メイトペア法
メイトペア法は、ゲノム上で数kb離れた領域を含むDNA断片を調製し、その両端を読み取る方法です。まずTransposome によりDNAを数kbの長さに断片化します。その際同時に断片化DNA末端へのビオチン標識アダプター付加が起こります。環状化しさらに細かく断片化を行います。ビオチンタグを用いてメイトペア末端領域を含むDNA断片を濃縮し、ペアエンド法と同様に2つのアダプターを用いてシーケンスを行います。 de novoアセンブルでのscaffold構築や、kb単位の大きな構造変異解析が可能となります。

  ●マルチプレックス法
DNA断片にインデックス(バーコード)配列を付加することで、1レーン最大24サンプル(デュアルインデックスでは96サンプル)をシーケンスできます。コスト・時間を削減し、且つ実験スループットを拡大することが可能です。Exome解析や疾患関連領域のDeepシーケンスなどターゲット領域に特化した研究や、ゲノムサイズが小さい生物種における株間の変異検出などの解析に有用です。

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●ロングリード法
ロングリード法では、マルチウェルプレートへのテンプレート分割と各ウェルごとのIndex付加により、100bpのショートリードから10Kbまでの合成ロングリードを構築します。
選択する解析オプションに応じて2通りの使用が可能です。
・de novoアセンブルやゲノムフィニッシングアプリケーションのために合成的にロングリードをアセンブルします。ロングリードを使用することでアライメントを容易に実施することができ、繰り返し配列などのこれまで解析が困難な領域の詳細情報を得ることにより、ゲノムアセンブルの精度を向上します。
・de novo変異をフェーズするとともに、共遺伝アリルやハプロタイプ情報を同定するためにゲノムフェージングを実施します。従来のトリオ解析や統計的推定に比べ包括的で精度の高いフェージングが可能です。

【ロングリード法ワークフロー】
ゲノムDNAを、10Kbの長さに断片化し、各フラグメントの末端にアダプターを付加します。
定量ののち、384wellプレートに分注し、断片を増幅します。
各Well内で断片化し固有のIndex配列を付加します。
サンプルをプールし、HiSeqペアエンドにてシーケンスを行います。
読み取ったリードはIndex(各Well)ごとに分け解析に使用します。


■ Illumina HiSeqからロングリードが登場!
詳しくはこちら

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  ■PacBio RSU 解析原理(Single Molecule Real Time Sequencing)

  ご提供いただいたゲノムDNAより、DNA断片を調製(※)した後、両末端にアダプターを付加し、ループ構造を持つライブラリを作成します。
ライブラリのアダプター部分にプライマーとポリメラーゼを結合させSMRT cellにアプライします。SMRT cell上には無数の孔が開いており(Zero-mode Waveguide:ZMW)、 このZMWの底面に1分子のDNA-ポリメラーゼ複合体が固定されます。 1塩基伸長反応の際に塩基毎に標識された蛍光色素を読み取り、シーケンスデータを取得します。
各ZMW内にてこの反応が並列的に実施されることで、大量のデータを1度の解析で得ることができます。

※ ゲノムDNA : 物理的断片化
  Total RNA : 逆転写によりcDNAを合成の後、
  サイズ分画(分画毎に、複数種のライブラリを 調製する)。

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